Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. 2001; 3(2):156-162
Разработаны 2 быстрых фенотипических метода определения дифтерийного токсина: иммуноферментный анализ (ИФА) и тест с иммунохроматографическими полосками (ICS). В обоих методах используются лошадиные поликлональные антитоксические антитела в качестве фиксирующих антител. Детектирующие антитела представлены моноклональными антителами, специфичными фрагменту А молекулы дифтерийного токсина, меченными щелочной фосфатазой для использования в ИФА, и коллоидным золотом – для ICS теста. Оба теста дают окончательный результат в течение 3 ч. Токсигенность может быть определена у штаммов, инокулированных на различных питательных средах. Чувствительность ИФА (по дифтерийному токсину) составляет 0,1 нг/мл, ICS теста – 0,5 нг/мл. При сравнении определения дифтерийного токсина с помощью ИФА, теста Элека и ПЦР у 245 штаммов коринебактерий (87 токсигенных и 158 нетоксигенных) результаты ИФА тесно коррелировали с данными теста Элека. Для сравнения ICS теста с тестом Элека исследованы 488 штаммов Corynebacterium spp. Результаты, полученные в ICS тесте, тесно коррелировали с данными теста Элека (243 токсигенных и 245 нетоксигенных штаммов). Проведена также оценка ICS теста для прямого определения токсигенности при исследовании 112 мазков, взятых из зева пациентов с подозрением на дифтерию и бессимптомных носителей. Результаты показали 98% сопоставимость (110⁄112) тестов с классическими культуральными методами при чувствительности 95 и специфичности 99%.
Дифтерия является острой инфекцией верхних отделов дыхательных путей, вызываемой токсинпродуцирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae. Значительно реже аналогичное по клинической симптоматике заболевание могут вызывать токсигенные штаммы Corynebacterium ulcerans.
Внедрение в практику здравоохранения массовой иммунизации в 40–50-е годы привело к значительному снижению заболеваемости и практически полной элиминации дифтерии в Великобритании и многих других странах. Однако недавняя эпидемия дифтерии в России и других странах свидетельствует о том, что эпидемическая заболеваемость может появиться там, где снижается охват профилактическими прививками [1].
В Западной Европе дифтерия встречается редко, однако наблюдается спорадическая заболеваемость. Причем большинство случаев инфекции связано с пребыванием в эндемичных районах: в Индостане, Юго-Восточной Азии, Южной Америки и в некоторых странах, образовавшихся из республик СССР [2, 3].
Дифтерийный токсин. Способность к продукции дифтерийного токсина (ДТ) – основной фактор вирулентности C.diphtheriae – возбудителя дифтерии.
ДТ состоит из одиночной полипептидной цепи с молекулярной массой 58350 Да, которая, в свою очередь, состоит из 3 структурно-функциональных доменов.
Содержащий аминогруппу компонент (фрагмент A) с молекулярной массой 21 кДа содержит домен, катализирующий с использованием НАД рибозилирование АДФ эукариотического фактора элонгации 2, который инактивирует синтез белка в клетках человека. Карбокситерминальный компонент токсина – фрагмент Б (39 кДа) – содержит эукариотический рецепторосвязывающий и гидрофобный домены, отвечающие за транспорт каталитического домена через эндосомальную мембрану в цитозоль [4, 5].
Только 3 представителя рода Corynebacterium являются потенциально токсигенными: C.diphtheriae, C.ulcerans и C.pseudotuberculosis. Способность этих видов к выработке ДТ зависит от действия двух факторов:
1) лизогении b-фагом или другими коринефагами, которые содержат структурный ген (tox-ген) молекулы токсина;
2) низкой внеклеточной концентрации железа [4, 5].
Именно с действием ДТ связаны большинство симптомов дифтерии и летальность от этой инфекции.
Несмотря на то что дифтерия является редким заболеванием в Великобритании и других странах Западной Европы, в последнее время значительно увеличилась частота выделения нетоксигенных штаммов C.diphtheriae [2, 6, 7]. В большинстве случаев они выделяются у пациентов с фарингитом. Однако имеются сообщения о случаях эндокардита и поражения других органов и систем в Европе [8, 9] и Австралии [10]. Вследствие этого надежные, специфичные и точные методы определения дифтерийного токсина необходимы для дифференциации спорадических токсигенных штаммов от циркулирующих нетоксигенных штаммов.
Методы определения дифтерийного токсина. Идеальный тест для определения токсигенности должен быть простым, быстрым, надежным и чувствительным, хорошо коррелировать с биологиче-ской активностью ДТ.
В последнее время исследовался ряд генотипических, фенотипических и биологических методов определения ДТ [11].
Молекулярные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения гена токсина обладают определенными преимуществами перед фенотипическими тестами. Они дают более быстрый и легко интерпретируемый ответ. Их использование становится все более распространенным вследствие большей доступности оборудования для ПЦР. Однако основной недостаток методов на основе ПЦР состоит в том, что они не дают информацию о способности микроорганизма к экспрессии биологически активного ДТ.
Описаны нетоксигенные, но в то же время tox-геннесущие штаммы (NTTB), обладающие частью полного гена ДТ, однако не способные к экспрессии биологически активной формы токсина [11, 12, 13]. Вследствие этого использование только ПЦР не дает окончательного результата при определении токсигенности. Поэтому ПЦР рекомендуется применять только как дополнительный к фенотипическим тестам метод [14, 15].
Тест иммунопреципитации Элека – наиболее часто используемый микробиологическими лабораториями всего мира фенотипический метод определения токсигенности. Проблема неправильной интерпретации неспецифических линий преципитации, особенно там, где тест Элека не выполняется рутинно, привела к снижению числа лабораторий, использующих его в своей работе, особенно в неэндемичных регионах.
Описаны различные фенотипические методы определения ДТ [11, 16–20], которые, однако, или не нашли широкого применения, или не имели существенных преимуществ по сравнению с тестом Элека для микробиологической диагностики дифтерии.
Иммуноферментный анализ (ИФА) и тесты с иммунохроматографическими полосками (ICS) широко использовались для выявления микробных антигенов и маркеров. Учитывая сказанное, мы разработали, стандартизировали и провели исследования амплифицированного ИФА и ICS теста для определения ДТ.
Штаммы. Бактериальные штаммы представлены клиническими изолятами, поступившими в Референтный отдел по стрептококкам и дифтерии ВОЗ/PHLS (SDRU) Центральной лаборатории общественного здравоохранения (CPHL, Лондон, Великобритания) в 1988–2000 г. При определении токсигенности использовали контрольные штаммы NCTC 10648 (токсигенная C.diphtheriae биотипа gravis), NCTC 3984 (слаботоксигенная C.diphtheriae биотипа gravis) и NCTC 10356 (нетоксигенная C.diphtheriae биотипа belfanti).
ИФА для определения дифтерийного токсина. Приготовление микротитровальных планшетов и конъюгата с моноклональными антителами. Очищенные лошадиные поликлональные антитоксические антитела класса G (2 мкг/мл; Pasteur Merieux, Лион, Франция) использовали для адсорбции в лунках микротитровальных планшетов Nunc Maxisorp (Nunc A/S, Роскилд, Дания).
Моноклональные антитела, специфичные для фрагмента А молекулы ДТ, были приготовлены в соответствии с ранее описанной методикой [16]. Очищенные моноклональные антитела класса G конъюгировали со щелочной фосфатазой и использовали в итоговой концентрации 2 мкг/мл. Для снижения неспецифического связывания была проведена оптимизация конъюгационного буфера (на основе Tris с альбумином бычьей сыворотки и неорганическими солями).
Иммуноферментный метод. Колонии коринебактерий с кровяного колумбийского агара суспендировали в 0,5 мл бульона Элека для получения плотности бактериальной взвеси, соответствующей 1 по стандарту мутности МакФарланда (1 x 108 КОЕ/мл), после чего инкубировали в течение 1 ч при температуре 37оC в аэробных условиях.
Бактериальные клетки удаляли путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Добавляли 200 мкл супернатанта отфильтрованной жидкости в лунки микротитровального планшета, а затем 50 мкл меченных щелочной фосфатазой (10 мкг/мл) моноклональных антитоксических антител. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37оC в аэробных условиях, после чего их промывали.
Для определения активности щелочной фосфатазы использовали реагент AmpliQ (DAKO Ltd, Эли, Великобритания) в соответствии с рекомендациями производителя. После 30-минутной инкубации при температуре 37оC реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1M фосфорной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм.
Тест с иммунохроматографическими полосками. Приготовление полосок для ICS теста. Полоски для ICS теста были приготовлены Программой соответствующих технологий в здравоохранении (PATH, Сиэтл, США). Лошадиные поликлональные антитоксические антитела наносили на нитроцеллюлозную мембрану в качестве фиксирующих антител. Моноклональные антитела, специфичные для фрагмента А молекулы ДТ, меченные коллоидным золотом, использовали как детектирующие антитела.
Тест ICS. Для определения токсигенности чистых культур штаммы с кровяного колумбийского агара (или сред, содержащих теллурит) суспендировали в 0,5 мл бульона Элека с целью получения плотности бактериальной взвеси, соответствующей стандарту мутности 1 по МакФарланду (1 x 108 КОЕ/мл). После этого инкубировали их в течение 3 ч при температуре 37оC в аэробных условиях.
Для прямого определения токсигенности тампоны с мазками из зева эмульгировали в 0,5 мл бульона Элека и инкубировали в течение 16 ч при температуре 37оC в аэробных условиях. При тестировании ICS вносили в каждую пробирку и оставляли при комнатной температуре на 10 мин, после чего считывали результаты.
Тест иммунопреципитации Элека. Все штаммы были протестированы на наличие ДТ с использованием ранее описанного модифицированного теста Элека [21].
Определение гена дифтерийного токсина с помощью ПЦР. Фрагмент A гена дифтерийного токсина (248 тпн) определяли в соответствии с ранее описанной методикой [12]. Для внутреннего контроля реакции использовали контрольный искусственный образец, содержавший внутреннюю делецию 58 тпн, что позволяло дифференцировать его от природного продукта по электрофоретической подвижности. Наличие ампликона размером 190 тпн при отрицательной реакции позволяло избежать ложноотрицательных реакций.
Определение цитотоксичности в культуре тканей. Метод определения цитотоксичности в культуре клеток Vero для определения ДТ проведен в соответствии с ранее описанной методикой [11]. Цитотоксический эффект определяли путем визуального обследования с использованием инвертированного микроскопа.
Чувствительность ИФА и теста ICS. Очищенный ДТ [Calbiochem-Novobiochem (UK) Ltd, Ноттингем, Великобритания] использовали для определения чувствительности ИФА и теста ICS. Пороги чувствительности составили соответственно 0,1 и 0,5 нг/мл.
Влияние питательной среды на определение токсигенности. Агаровые среды для выращивания микроорганизмов. Штаммы инокулировали на различных средах до исследования в тесте ICS, включая теллуритовый агар Хойла (Oxoid, Басингсток, Великобритания), агары Тинсдаля (Beckton Dickinson, Оксфорд, Великобритания), Леффлера (Oxoid, Басингсток, Великобритания), коринебак-агар (НПО "Питательные среды", Оболенск, РФ) и среду Пизу (приготовленную в лаборатории в соответствии с приказом Минздрава России № 570).
Положительная реакция в тесте ICS наблюдалась у всех исследованных токсигенных штаммов независимо от использованной среды, на которой они выращивались до инокуляции в бульоне Элека.
Жидкие среды для определения продукции ДТ. Оценивали рост и токсинообразование в тесте ICS в бульонах Элека и ГРМ (НПО "Питательные среды", Оболенск, РФ).
Положительная реакция наблюдалась у всех исследованных токсигенных штаммов независимо от использованного бульона.
Оценка ИФА. ИФА оценивали с использованием 245 штаммов коринебактерий, переданных в SDRU в 1988–1998 гг., в сравнении с тестом иммунопреципитации Элека [21] и ПЦР на определение фрагмента А гена ДТ [12].
Виды и биотипы исследованных штаммов представлены в табл. 1. Они включали как потенциально токсигенные виды (C.diphtheriae, C.ulceransи C.pseudotuberculosis), так и другие Corynebacterium spp.
Таблица 1. Сравнение определения токсигенности с помощью ИФА, модифицированного теста Элека и ПЦР на определение фрагмента А гена дифтерийного токсина
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
* Время до получения результата
При использовании оптической плотности 0,05 в качестве пороговой при определении токсигенности в ИФА были установлены 87 токсигенных и 158 нетоксигенных штаммов. Изоляты C.ulcerans оказались слабыми продуцентами токсина (самые низкие показатели уровней абсорбции). Это подтверждает данные о том, что C.ulcerans часто дают очень слабые линии преципитации в тесте Элека.
Результаты, полученные в ИФА, в 100% случаев коррелировали с данными модифицированного теста Элека (табл. 1). Однако они были получены в течение 3 ч от момента отбора колоний (в сравнении с таковыми через 24 ч для модифицированного и через 48 ч для классического теста Элека).
Тест ИФА также продемонстрировал большую чувствительность, чем тест Элека, а интерпретация результатов оказалась проще. Со штаммами, дававшими слабые линии преципитации в тесте Элека, получена хорошо видимая цветная реакция в ИФА, что позволяло легко их дифференцировать от нетоксигенных штаммов при визуальной интерпретации.
С 10 (4,1%) из 245 штаммов получены отрицательные результаты в ИФА и тесте Элека, однако положительный – на наличие tox-гена в ПЦР. У этих штаммов также был отрицательный результат при определении цитотоксичности в тесте с культурой клеток Vero, в связи с чем они были оценены как нетоксигенные.
Оценка теста ICS. Результаты использования теста ICS для определения токсигенности чистых культур и мазков из зева пациентов с подозрением на дифтерию и бессимптомных носителей оценивали в исследованиях на Украине и в Латвии.
Всего 488 потенциально токсигенных штаммов коринебактерий исследованы в тестах Элека и ICS: 486 штаммов C.diphtheriae (301 биотипа gravis, 183 биотипа mitis и 2 биотипа belfanti) и 2 – C.ulcerans.
Выявлена 100% корреляция между результатами теста Элека и ICS (243 токсигенных и 245 нетоксигенных штаммов). Далее в ICS тесте исследованы 76 нетоксигенных, tox-геннесущих (NTTB) штаммов (элекотрицательных, ПЦР-положительных).
Для 68 (89,5%) из 76 штаммов результат ICS теста совпадал с тестом Элека (нетоксигенные штаммы). Оставшиеся 8 изолятов дали положительный результат в ICS тесте и были повторно исследованы на наличие токсигенности в тестах ICS, Элека и ПЦР лабораторией, выделившей штамм, и в лаборатории PHLS. Все штаммы оказались токсигенными при исследовани тремя указанными методами.
Для оценки прямого определения ДТ с помощью теста ICS в сравнении с классическими культуральными методами исследованы 112 мазков из зева. Результаты тестирования приведены в табл. 2. Чувствительность теста ICS составила 95% (интервал согласия – 0,74–1), специфичность – 99% (интервал согласия – 0,74–1).
Таблица 2. Прямое определение токсигенности из клинических образцов (мазки из зева) с использованием теста ICS
| ||||||||||||||
Определение токсигенности – наиболее важное исследование при лабораторной диагностике дифтерии. Оно должно проводиться немедленно после выделения всех подозрительных колоний.
Применяющиеся в настоящее время фенотипические методы определения токсигенности с технической точки зрения сложные и часто недостаточно чувствительные [11, 20]. Более того, они занимают не менее 16–24 ч после выделения колоний до получения окончательного результата. Это обстоятельство не удовлетворяет ни клиницистов, ни эпидемиологов, ни специалистов в области общественного здравоохранения.
Непосредственное определение гена ДТ – наиболее быстрый метод оценки токсигенности с использованием чистых культур. Он занимает 4–5 ч с момента выделения колоний. Кроме того, в настоящее время разработан метод прямого определения гена ДТ из клинических образцов [22].
Несмотря на то что рядом исследователей показана тесная корреляция между генотипическими (ПЦР) и фенотипическими методами определения токсигенности [22, 23, 24, 25], некоторыми авторами описаны штаммы, обладавшие tox-геном, но не экспрессировавшие биологически и/или иммунологически активные формы токсина [11, 13].
Подобные штаммы встречались относительно редко в определенных регионах (на севере США и в Канаде) [11]. Однако на спаде эпидемии дифтерии в странах, образовавшихся из республик Советского Союза, подобные штаммы стали выделяться в большем количестве [15]. Из 564 чистых культур 68 (12%), включенных в исследование в странах, образовавшихся из республик Советского Союза, обладали tox-геном, но не экспрессировали биологически активную форму токсина. Именно поэтому в современных руководствах рекомендуется использование ПЦР только в сочетании с фенотипическим тестом [14, 15].
Несмотря на то что истинный отрицательный результат ПЦР может быть использован для быстрого исключения токсигенности, положительный результат реакции требует подтверждения фенотипическим тестом, что потенциально чревато задержкой получения окончательного результата.
ИФА и ICS тест – быстрые, чувствительные и простые методы определения ДТ с порогами чувствительности 0,1 и 0,5 нг/мл соответственно. Для чистых культур результат может быть получен в течение 3 ч с момента отбора колоний. В связи с этим тесты могут быть использованы для получения окончательного результата определения токсигенности в течение рабочего дня.
Токсигенность может быть определена у штаммов, выросших на различных питательных средах, включая селективные агары, используемые для выделения и скрининга потенциально токсигенных коринебактерий. В их число входят среды, используемые в странах Западной Европы (теллуритовый агар Хойла, агар Тинсдаля), а также в странах, образовавшихся из республик Советского Союза (коринебакагар и среда Пизу).
Стандартизация плотности бактериальной взвеси и времени инкубации в бульоне Элека являются необходимыми условиями для определения токсигенности, особенно у слаботоксигенных штаммов. Мы определили, что плотность взвеси 1 x 108 КОЕ/мл (1 по стандарту МакФарланда) и одночасовая (для ИФА) или 3-часовая (для теста ICS) инкубация в бульоне Элека могут быть успешно использованы без наличия ложноотрицательных результатов.
Один из потенциальных недостатков ИФА – необходимость использования жидкого моноклонального конъюгата и реагента для амплификации, которые требуют хранения при температуре 4оC и имеют относительно малый срок хранения. Однако с адаптацией ИФА к формату ICS теста устраняются некоторые проблемы.
Так, ICS остаются стабильными при хранении при комнатной температуре минимум один год. По нашему мнению, разработку этих простых фенотипических методов можно считать значительным достижением в области микробиологической диагностики дифтерии. Они могут быть использованы для тестирования ДТ у клинических штаммов коринебактерий как в странах со спорадической заболеваемостью дифтерией, так и при исследовании большого количества штаммов в регионах с эпидемической заболеваемостью.
Благодарность. Данное исследование поддержано Европейской комиссией DG RTD программой ИНКО Коперникус IC15.CT.98.0302. Выражаем признательность и благодарность И.К. Мазуровой, Г.Я. Ценевой, Л.П. Титову, С.А. Габриелян и В.Е. Киму (партнеров программы ИНКО Коперникус) за оценку теста ICS в своих лабораториях.